军团菌鉴定_军团菌_嗜肺军团菌

军团菌检测方法

广东省微生物研究所提供军团菌检测服务工作,其鉴定数据可获得国际互认,具有法律效力。隶属广东省科学院。

联系人:林小姐:020-87688142

检测方法有:

1、《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(卫生部,2006年)

2、11731-1998。

军团菌属有41个种,61个血清型。侵肺军团菌( , )有15个血清型,是引起军团菌病的主要菌型(占80%以上)。军团菌病是一种急性呼吸道传染病,临床类型目前至少有肺炎型与庞蒂阿克热型。本病主要为呼吸道飞沫(气溶胶)传播。目前尚无证据表明感染者、病人或感染动物作为本病的传染源,通常把传染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷却塔、冷热管道系统水等)作为传染源。

11731-1998:

1 取样

1.1取样容器

水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。以前用过的容器应该清洗干净、扣干水分,121℃高压灭菌15。如果容器不能经受高压灭菌,应在〉70℃的流动热水或流动蒸汽中处理至少5。

1.2含生物防腐剂的样品

如果水样中含有或被认为含有氧化型生物防腐剂,应在取样时或取样前加入非活性试剂加以中和。

原则上讲,实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析,最好是取样当天,尤其对于已知含生物防腐剂的样品。因此,建议从样品采集到制备好浓缩样的间隔最好为2,不应超过5,最长不超过14。

1.3样品运输

样品应在6-18℃条件下被运输,应避免热和光照,最好在1内,不超过2将样品送到指定实验室。

2. 制样

2.1 总则

如果液体样品军团菌的数量估计超过105/,可以采用直接平板法。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测,需采用浓缩技术。为了浓缩水样,可采用膜过滤法(4.2)或离心法(4.3)。

2.2膜过滤法

如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的,应采用离心法。

采用膜过滤装置进行膜过滤,采用直径47-147,孔径0.22μ和0.45μ的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中,可用无菌剪刀剪碎,加5-25的无菌稀释液或无菌去离子水,不断摇动至少2。也可将容器放入超声波中2-10。

2.3离心法

取200样品于300-500容积的离心瓶中,6000离心10或3000离心30,保持温度在15-25℃,弃去上清液,将沉淀物悬浮在2-20无菌稀释液或无菌去离子水中。

3. 培养

3.1将制备好的样品(浓缩的或未浓缩的)分成3份,1份不做任何处理;1份进行热处理;1份进行酸处理。

3.2热处理

加1±0.5样品于一无菌容器中,50±1℃水浴处理30±2。

3.3酸处理

加1-10样品于一拧盖的容器中,6000离心10或3000离心30,用无菌枪头吸去一半体积的上清液,通过涡旋重新悬浮剩余物,用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5±0.5。

3.4选择性培养基的接种

分别接种未处理、热处理和酸处理的样品0.1-0.5于培养基上,热处理和酸处理的样品应在处理完立即接种,记录接种体积。

3.5培养

翻转平板,36±1℃培养10。

3.6检查平板

在10的培养期间,用显微镜在2-4内至少观察3次,军团菌生长较慢,很可能被其他菌掩盖,记录每一种菌落形态的数量。

注:军团菌的菌落通常是白-灰-蓝-紫,但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑,边缘整齐,出现典型的毛玻璃现象。在紫外光下, ., ., ., ., ., ., ., .和.有亮白色荧光;. 和.呈现红色;.菌落呈现暗绿色通常伴随有黄色。荧光的颜色有助于区分样品中军团菌的不同种。为了避免军团菌的死亡,不能将平板长时间暴露在紫外灯下。

3.可疑军团菌的确证

3.1和其他培养基的二次培养

从每个平板上至少选择3个可疑军团菌菌落接种到和-两块平板上进行二次培养,36±1℃培养至少2。在上生长而在-上不生长的被认为是军团菌。通过血清学实验(6.2)确证在上生长而在-上不生长的菌落。

注:血琼脂和营养琼脂可以代替-培养基。

《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(卫生部,2006年),

附录:

冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法

本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。

1原理

待测水样经过滤膜或离心浓缩后,一部分样品经酸处理与热处理,以减少杂菌生长,一部分样品不作处理。将上述处理与未处理样品分别接种琼脂平板并进行培养,生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。

2 主要仪器设备

2.1 平皿:90

2.2 培养箱:35~37℃

2.3 紫外灯:波长360±2

2.4 滤膜滤器

2.5 滤膜:孔径0.22~0.45μ

2.6 蠕动泵

2.7 离心机

2.8 涡旋振荡器

2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜

2.10 水浴箱

3 采样

3.1 采样容器:可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶,沉积物与软泥需用广口瓶,容器均需螺口或磨口,用前灭菌。

3.2 采样量:每个采样点依无菌操作取水样(或沉积物、软泥等样品)约200。

3.3 中和:经氯或臭氧等消毒的样品,采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。

3.4 样品运输与贮存:样品最好2天内送达实验室,不必冷冻,但要避光和防止受热,室温下贮存不得超过15天。

4 方法与步骤

4.1 样品处理

4.1.1 沉淀或离心:如有杂质可静置沉淀或1000/离心1去除。

4.1.2 过滤:将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22~0.45μ滤膜过滤,取下滤膜置于15灭菌水中,充分洗脱,备用。

4.1.3 热处理:取1洗脱样品置50℃水浴加热30。

4.1.4 酸处理:取5洗脱样品,调至2.2,轻轻摇匀,放置5。

4.2 接种与培养:取4.1.2洗脱样品、4.1.3 热处理样品及4.1.4 酸处理样品各0.1,分别接种平板。将接种平板静置于2培养箱中,温度为35~37℃,2浓度为2.5%。无2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时,反转平板,孵育10天,注意保湿。

4.3 观察结果:军团菌生长缓慢,易被其它菌掩盖,需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样,通常呈白色、灰色、蓝色或紫色,也能显深褐色、灰绿色、深红色;菌落整齐,表面光滑,呈典型毛玻璃状,在紫外灯下,有荧光。

4.4 菌落验证:从每一个平皿上挑取2个可疑菌落,接种和-半光氨酸缺失的琼脂平板,35~37℃培养2天,凡在琼脂平板上生长而在-半光氨酸缺失的琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。

4.5嗜肺军团菌型别的确定:应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养:氧化酶(-/弱+),硝酸盐还原-,尿素酶-,明胶液化+,水解马尿酸。血清学实验:用嗜肺军团菌诊断血清进行分型

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军团菌检测方法

军团菌概况

军团菌是一种环境感染性致病菌,可引起急性呼吸道传染病,即军团菌病。军团菌分布极其广泛,医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌,并造成军团菌病传染的风险。即与水有关的地方均可能存在军团菌。

军团菌传播、感染有以下特点:

1、透过空气、水份感染,传播带季节性,超过50%病例在夏季发生。

2、滋生在医院、酒店的供水系统,通过过水龙头、浴室传播。

3、可通过空调的冷却系统,由通风口传播并感染对象。

军团菌属革兰氏阴性杆菌,专性需氧,无芽孢,无荚膜,军团菌需要半胱氨酸和铁,无半胱氨酸时,军团菌无法生长。生化特征还有不发酵也不氧化糖类,不还原硝酸盐,氧化酶实验阴性或弱阳性,尿素酶阴性,军团菌生长的最适为6.9-7.0,2%-5%2能促进部分菌株的生长。军团菌生长缓慢,易于被其它菌落覆盖。军团菌的菌落颜色多样,通常呈白色、灰色、蓝色或紫色,也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐,表面光滑,在紫外灯下,有荧光。目前军团菌分为64种血清型及42个种。

11731水样中军团菌检测方案

采样:一般用玻璃或聚乙烯等无菌容器采样。如果水样中含有消毒剂,需在采样前或采样后加入中和剂,含氯或氧化型消毒剂可用硫代硫酸钠或硫代硫酸钾作中和剂。水样应当天检测为佳。

样品富集:如果样品中军团菌的数目预计多于105/,直接取样涂布于平板上分离培养检测。如果样品中军团菌的数目未知或较少时,一般采用滤膜法或离心法富集军团菌。

滤膜法:将水样以0.22μ滤膜过滤浓缩,然后加入5无菌水,超声波振动混匀3后为浓缩样品。

离心法:将水样置于高速离心机中,6000离心15,(15℃-25℃),弃去上清,然后加入2-10无菌水,混匀后为浓缩样品。

样品处理:将浓缩样品分三份,一份直接取样涂布于平板上分离培养。一份酸处理:2浓缩液+2缓冲液(0.2/的 3.9+

0.2/的

25,溶液调2.0±0.2),摇匀5±0.5。取样涂布于平板上分离培养。一份热处理:2浓缩液于50±1℃水浴30±1。即三种处理方法的结果分别取样涂布于选择性平板上培养分离。

革兰氏染色:军团菌生长较慢,次日生长的菌落可直接弃去。军团菌菌落颜色多样,通常呈白色、灰色、蓝色或紫色,也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐,表面光滑,在紫外灯下有荧光。军团菌为革兰氏阴性杆菌。

菌落验证:从每个平皿上选几个可疑菌落,接种、-平板和血平板进行传代培养,凡在平板上生长,而在-平板上不生长的菌极可能是军团菌。

军团菌计数:从三个平板中选择确证菌数最多的平板进行计数,再除以浓缩倍数,作为军团菌数的估计值。

鉴定:对于极可能是军团菌的菌落可作血清分型、生化或等鉴定实验。

杀灭军团菌

杀菌溶液是复合型的消毒溶液,主要成分是次氯酸,并含有臭氧、二氧化氯、双氧水等多种高效消毒成分。不仅可以快速杀灭所有细菌,而且可以清除生物膜,做到真正的彻底杀菌。任何一种单一成分的消毒产品,杀菌能力和效果都无法与杀菌溶液相比,任何细菌对它没有耐受性,高效、广谱、安全和环保。

七、选用丹麦杀菌消毒剂生产机组的理由有以下几点

八、军团菌最新情况

附:典型案例

项目名称

项目应用

设备型号

安装数量

英国国民健康服务医院()

( )

医院热水系统

及生活用水系统

250040

1台

丹麦健康中心

热水系统

及生活用水系统

250040

1台

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